Author(s): Huang Sijian, Liu Chang, Qin Zelian
Pages: 658-662
Year: 2009 Issue:  7
Journal: Chinese Journal of Minimally Invasive Surgery
Keyword:  Thymosin β4; 293T细胞; RNA干扰; 慢病毒;
Abstract: 目的 探讨人胸腺素β4(thymosin β4,TMSB4)基因RNA干扰慢病毒载体的构建,观察病毒感染293T细胞后TMSB4 mRNA和蛋白表达,为进一步研究TMSB4基因的功能提供基础.方法 设计特异性干扰人TMSB4基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNA oligo,与经Age I和EcoR I双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生慢病毒载体.转化感受态大肠杆菌DH5a并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定.慢病毒载体、包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将获得的慢病毒感染293T细胞,分别采用实时定量PCR和免疫细胞化学染色方法 观察 TMSB4mRNA和蛋白的表达情况,利用生成的 TMSB4 shRNA慢病毒感染原代成纤维细胞.结果 感染重组慢病毒的293T细胞与空病毒转染阴性对照细胞的TMSB4 mRNA表达分别为0.56±0.11和1.00±0.06(P=0.0006),实验组细胞的敲减率为44%.实验组TMSB4蛋白表达水平0.042±0.007比阴性对照组细胞0.093±0.009的表达降低55%(H=461.342,P<0.001).感染重组慢病毒的原代培养的成纤维细胞与空病毒转染的对照细胞相比,TMSB4蛋白表达水平亦明显降低.结论 TMSB4基因干扰慢病毒构建成功并能显著降低TMSB4基因和蛋白在293T细胞中的表达,成功感染原代成纤维细胞使其目的 基因蛋白减少,为进一步研究TMSB4基因的功能奠定研究基础.